細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，利用凍存技術(shù)將細(xì)胞冷凍保存在-196C℃液氮中，可以使細(xì)胞暫時(shí)停止生長并保留細(xì)胞特性，以便在需要時(shí)再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。同時(shí)保存適量的細(xì)胞，可以防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中因受到污染或其他意外事件導(dǎo)致細(xì)胞丟種，起到細(xì)胞保種的作用。

一、冷凍"慢條斯理"，復(fù)蘇“眼疾手快"

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇采取"慢凍快融"的原則，慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水份滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的機(jī)會;快融以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)冰晶造成對細(xì)胞的損傷。

二、“高高M(jìn)興上班，平平安安回家"

細(xì)胞凍存時(shí)需向培養(yǎng)基中加入冷凍保護(hù)劑，可保護(hù)細(xì)胞在冷凍時(shí)免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護(hù)劑可根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜分為滲透性和非滲透性兩類:

1、滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2、非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。

三、細(xì)胞凍存的“按部就班"

1、準(zhǔn)備已滅菌的凍存培養(yǎng)液，并4℃預(yù)冷;

2、選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用細(xì)胞消化酶（如胰蛋白酶）進(jìn)行消化，適時(shí)去掉消化液，加入少量新鮮培養(yǎng)液。懸浮生長的細(xì)胞不進(jìn)行消化處理，直接將細(xì)胞收集于離心管中離心，1000 rpm，5-10 min;

3、棄去上清液，逐漸加入適量預(yù)冷的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度在5×106~1×107/mL之間;

4、將上述細(xì)胞分裝于2 mL凍存管中，每管1-1.5 mL。在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存日期和操作者;

5、凍存∶標(biāo)準(zhǔn)的降溫速率開始為-1~-2C/ min，當(dāng)溫度降到-8O℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20°℃冰箱2h，然后放入-80°℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

四、細(xì)胞復(fù)蘇的“按部就班"

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃水浴中，并不時(shí)搖動使其盡快融化;

2、從37C水浴中取出凍存管，在無菌條件下取出細(xì)胞，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻，以1000 rpm，5-10min離心;

3、棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度后接種到培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);4、次日更換—次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

五、前方高能預(yù)警

1、配制好的細(xì)胞凍存液要進(jìn)行預(yù)冷，新鮮配制的凍存液會產(chǎn)生大量的熱。

2、凍存的細(xì)胞在半年后，建議取出一只凍存管細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。

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